（1福建省農業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫研究所2 廣州市華南農大生物藥品有限公司）
基金項目：現代農業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設專(zhuān)項資金（CARS-43），福建省農業(yè)五新工程項目（閩發(fā)改投資（2012）931號）
摘要：目的：觀(guān)察十二烷基硫酸鈉（SDS）肌注對家禽的副作用；建立檢測禽霍亂莢膜粗提物中的SDS殘留量的方法。方法：肌肉注射0.01％SDS溶液、0.05％的SDS溶液，觀(guān)察家禽的全身及局部反應。不同濃度SDS溶液與吖啶橙混合，作用后甲苯抽提，測定499nm的光吸收值，建立回歸方程。根據待檢品的光吸收值求出其SDS濃度。結果：肌注后1天內，所有家禽在注射部位均有輕微的壓痛表現，1天后緩解，繼續觀(guān)察至14天，未見(jiàn)家禽表現全身和局部反應。 當SDS的濃度在0.001％~0.005％時(shí)，與OD499呈線(xiàn)性相關(guān)，相關(guān)系數為0.9969。結論：0.01％和0.05％的SDS溶液肌注，對家禽沒(méi)有副作用。吖啶橙-分光光度法可以用來(lái)檢測禽霍亂莢膜粗提物中的SDS殘留。
關(guān)鍵詞：多殺性巴氏桿菌 莢膜 吖啶橙 SDS
禽霍亂，又名禽巴氏桿菌病、禽出血性敗血癥，是侵害家禽和野禽的一種慢性或急性接觸性傳染病。該病急性發(fā)作時(shí)表現敗血癥，發(fā)病率和死亡率都很高，慢性型則病情緩和，通常只引起肉髯或關(guān)節等局部的感染。許多抗菌藥物能迅速控制本病，但停藥后易復發(fā)，造成的損失極大。林世棠等以特殊工藝提取其莢膜，制成禽霍亂莢膜亞單位疫苗，近期免疫保護率為80％以上[2-7]。在禽多殺性巴氏桿菌莢膜的提取過(guò)程中，需加入一定量的十二烷基硫酸鈉（SDS），雖然在后續的工藝中含有去除SDS的步驟，但其殘留是不可避免的。過(guò)量的SDS會(huì )對機體產(chǎn)生副作用，人用生物制品中該殘留量應控制在0.05％左右的安全范圍內[8、9]。SDS殘留對家禽的影響尚未見(jiàn)報道，本試驗觀(guān)察0.01％和0.05％的SDS溶液肌注后，SPF雞、麻鴨和長(cháng)樂(lè )灰鵝的全身及局部反應，為禽用生物制品中SDS的殘留范圍規定提供依據，同時(shí)還建立了檢測莢膜提取物中SDS殘留的方法，現報道如下。
1 材料與方法
1.1儀器
UV1600型紫外可見(jiàn)分光光度計，北京瑞利分析儀器公司。
1.2 試劑及溶液的配制
吖啶橙，Biosharp公司產(chǎn)品；SDS，Sigma公司產(chǎn)品；NaHSO4·H2O，甲苯，均為分析純。
稱(chēng)取6.9000g的NaHSO4·H2O加入雙蒸水溶解，定容至100mL，為0.5M NaHSO4溶液。
稱(chēng)取0.4000g的吖啶橙，加入0.5M NaHSO4溶液溶解，定容至100mL，為0.4％吖啶橙溶液。
稱(chēng)取0.1000g的SDS，加入雙蒸水溶解，定容至100mL，為0.1％的SDS溶液。取少量稀釋成0.01％和0.05％的濃度，用于動(dòng)物試驗；取少量稀釋成0.001％、0.002％、0.003％、0.004％和0.005％，作為檢測的標準品。
待檢品為禽多殺性巴氏桿菌莢膜粗提物，批號為20131211、20131215、20131220和20131228，由本實(shí)驗室制備。
1.3 不同濃度SDS溶液對禽類(lèi)的影響
選擇30日齡的SPF雞、麻鴨和長(cháng)樂(lè )灰鵝，詳細分組見(jiàn)表1，0.01％的SDS溶液（濾膜除菌）、0.05％的SDS溶液（濾膜除菌）、滅菌生理鹽水，分別肌注10羽實(shí)驗動(dòng)物，每羽于左、右腿部肌肉各注射1mL。同條件隔離飼養14天，提供充足的飼料和飲水。期間每日觀(guān)察實(shí)驗動(dòng)物的臨床狀況，包括精神狀態(tài)、行為活動(dòng)、眼睛和鼻孔分泌物、采食和排便情況等；局部不良反應包括紅腫、硬結、瘙癢和壓痛等。分別于肌注后1天、3天和5天各撲殺2羽，觀(guān)察注射部位的肉眼變化。
1.4 SDS濃度與光吸收值的對應關(guān)系
取100μL標準品于帶塞試管中，加入100μ L0.4％吖啶橙溶液混勻。加入3mL甲苯后塞緊試管，劇烈振蕩3min，3000g離心5min，吸上清測定499nm處的光吸收值，用雙蒸水作參比。每個(gè)標準品進(jìn)行3個(gè)重復，取平均值。以SDS濃度為橫坐標，以光吸收值為縱坐標，繪制曲線(xiàn)，求相關(guān)系數，建立回歸方程。
1.5 待檢晶SDS殘留量的測定
方法同1.4，每個(gè)待檢品進(jìn)行3個(gè)重復，取平均值。將光吸收值代人回歸方程，計算待檢品的SDS濃度。
2 結果
2.1 SDS溶液對禽類(lèi)的影響
0.01％的SDS溶液、0.05％的SDS溶液和生理鹽水注射后，各組動(dòng)物的臨床表現相似，精神狀態(tài)良好，行為活動(dòng)正常，眼睛和鼻孔無(wú)異常分泌物，采食和排便正常。肌注后1天內，所有動(dòng)物在注射部位均無(wú)出現紅腫、硬結，但有輕微的局部壓痛表現。肌注后1天，局部壓痛消失，觀(guān)察到肌注后14天，注射部位仍無(wú)硬結。肌注后1天撲殺，各試驗組表現相同，僅在注射部位見(jiàn)小出血點(diǎn)。肌注后3天撲殺，各試驗組表現相同，在注射部位肉眼見(jiàn)不到異常變化。肌注后5天撲殺，各試驗組均沒(méi)有肉眼可見(jiàn)病變。
2.2 SDS濃度與光吸收值的回歸曲線(xiàn)
各標準品的平均光吸收值見(jiàn)表2，以SDS濃度為橫坐標，以光吸收值為縱坐標，繪制的標準曲線(xiàn)見(jiàn)圖1，當SDS的濃度在0.001％~0.005％時(shí)，相關(guān)系數為0.9969，回歸方程為y=50.4x-0.002。
2.3 待檢品SDS殘留量的計算
各待檢品的平均光吸收值見(jiàn)表2，全部在0.043~0.247，直接將光吸收值代人回歸方程，計算出的SDS殘留量見(jiàn)表2，4批莢膜粗提物的SDS殘留量全部低于0.005％，遠低于目前0.05％的殘留標準。
3 討論
目前人用生物制品SDS的殘留量公認的安全指標為0.05％，但獸用生物制品SDS的殘留量安全指標沒(méi)有明文規定。本試驗以30日齡的SPF雞、麻鴨和長(cháng)樂(lè )灰鵝為實(shí)驗動(dòng)物，肌肉注射2 mL的0.01％SDS溶液、0.05％的SDS溶液，除第一天有局部壓痛外，未見(jiàn)全身反應及其他的局部反應，說(shuō)明家禽肌肉注射0.05％的SDS溶液是安全的。
吖啶橙-分光光度法的原理是用吖啶橙溶液與SDS結合，產(chǎn)生SDS-吖啶橙復合物，再用甲苯從水溶液中抽提出來(lái)進(jìn)行比色測定[10]。許國杰等（2002）和吳慶洲等（2010）也將該方法用于重組人白細胞介素和雙質(zhì)粒疫苗中SDS的檢測，證實(shí)是可行的。本試驗參考他們的方法，當SDS的濃度在0.001％~0.005％時(shí)，相關(guān)系數為0.9969，此時(shí)，OD吸收值與SDS的濃度相關(guān)性非常強。測定了4批禽多殺性巴氏桿菌莢膜粗提物的SDS殘留，均在0.005％以下，對家禽是安全的。
參考文獻
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